Заложена 5 февраля 1930 года на заводе № 189 (Балтийский завод) в Ленинграде под стапельным номером 199. На церемонии закладки корабля присутствовал член РВС СССР, начальник Военно-Морских Сил РККА Р.А. Муклевич. 1 декабря 1930 года подводная лодка спущена на воду. 11 октября 1933 года она вступила в строй и 14 октября 1933 года под командованием Шергина Александра Петровича вошла в состав Морских сил Балтийского моря.

    В сентябре 1939 года «Щ-301» под командованием Иванова Бориса Владимировича принимала участие в патрулировании Финского залива. Осенью 1939 года лодка встала на капремонт и модернизацию. Ремонтные работы завершились только перед началом Великой Отечественной войны, хотя по показаниям перебежавшего в 1943 году на сторону врага, главстаршины с «Щ-303» Галкина, «Щ-301» 14 июня 1940 года приняла участие в инциденте с самолетом «Калева» финской авиакомпании «Аэро», сбитым советскими летчиками над Финским заливом.

    22 июня 1941 года подводная лодка встретила под командованием капитан-лейтенанта Грачева Ивана Васильевича (назначен на «Щ-301» за несколько дней до начала войны) в составе Отдельного учебного дивизиона ПЛ КБФ в Ораниенбауме.

    10 августа 1941 года лодка вышла в свой первый боевой поход к Стокгольмским шхерам (позиция № 11). 12 августа «Щ-301» заняла назначенный район. 17 августа она обнаружила транспорт, но атака сорвалась из-за того, что лодка провалилась на глубину в результате заполнения водой торпедного аппарата. 19 августа 1941 года «Щ-301» обнаружила конвой, но была освещена прожектором и подверглась атаке корабля эскорта. Всплыв через 40 минут, командир субмарины увидел все тот же транспорт, стоящий на якоре, и удаляющийся эсминец. Незамедлительно была произведена торпедная атака (выпущено 2 торпеды типа «53-27»), а вскоре на подводной лодке услышали взрывы, и командир субмарины посчитал транспорт потопленным. На самом деле безрезультатной атаке подвергся германский транспорт «Теда Фритцен» (288 брт), который Грачев оценил в 8.000 тонн.

    Корабль ещё дважды (23 и 24 августа 1941 года) выходил в атаки, но в первом случае торпеда заработала в торпедном аппарате, а во втором, хотя на лодке и слышали взрывы, а командир субмарины оценил результат атаки как потопление транспорта водоизмещением 4.000 тонн, подтверждения успеха «Щ-301» со стороны неприятеля нет. Шведский эсминец, эскортировавший конвой, видел след торпеды. 25-27 августа «Щ-301» наблюдала за маневрами шведского флота, однако не атаковала, имея четкие указания на это. В ночь на 27 августа 1941 г. лодка была срочно отозвана с позиции и 28 августа благополучно вернулась в Таллин в тот момент, когда наши войска уже оставили город. Вместе с флотом «Щ-301» направилась в Кронштадт в составе эскорта Третьего транспортного конвоя (по другим данным лодка шла в составе Отряда прикрытия, следуя в кильватере спасательного судна «Нептун»).

    Около 21.15. 28 августа 1941 года в районе острова Кери «Щ-301» кормой подорвалась на мине заграждения «F-22», выставленном финскими минзагами «Риилахти» и «Руотсинсальми». Лодка осталась на плаву. Командир, осмотрев повреждения, пришел к выводу, что борьба за живучесть корабля бесполезна (гребные валы загнуты вверх, IV отсек вскрыт, из кормового аппарата вывалилась торпеда), отдал приказ покинуть корабль. Подошедшие сторожевые катера сняли с лодки остатки экипажа - 14 (по другим данным 13) человек и передали их на штабное судно «Вирония». Через две минуты после этого «Щ-301» ушла под воду. Вместе с лодкой погибло 22 человека. «Вирония» вскоре так же погибла на мине. Из оставшихся в живых членов экипажа «Щ-301» до Кронштадта удалось добраться командиру субмарины Грачеву и одному краснофлотцу.